МОЛЕКУЛЯРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ В СИСТЕМЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА ЗА ИНФЕКЦИЯМИ, СВЯЗАННЫМИ С ОКАЗАНИЕМ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ

Учитывая указанные выше преимущества методов молекулярно-генетического типирования по сравнению с фенотипическими (немолекулярными) методами, при реализации эпидемиологического наблюдения за ИСМП молекулярно-генетическому типированию следует отдавать предпочтение при наличии в лаборатории ЛПМО технических возможностей для проведения данного типа исследования. Применение методов молекулярно-генетического типирования позволяет сократить время, затрачиваемое на идентификацию госпитальных и эпидемически значимых штаммов микроорганизмов, и своевременно проводить противоэпидемические мероприятия.

Молекулярно-генетическое типирование является методом выбора в следующих ситуациях:

Проведение молекулярно-генетического типирования обязательно при оценке идентичности изолятов микроорганизмов, выявленных из различных источников, и нерезультативном применении при этом комплекса традиционных (фенотипических) методов.

Молекулярно-генетическое типирование возбудителей ИСМП основано на выявлении специфических генетических особенностей штаммов возбудителя, общих для штаммов, происходящих из одного источника, и различающихся у штаммов из разных источников -генетических маркеров (маркеров геномного полиморфизма).

Генетические маркеры представляют собой участки нуклеотидных последовательностей ДНК или РНК микроорганизма. К их числу относят различные повторяющиеся последовательности ДНК, сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, мобильные генетические элементы, точечные мутации в отдельных генах «домашнего хозяйства». Ниже приводим краткую информацию о наиболее часто используемых генетических маркерах.

Повторяющиеся последовательности ДНК включают прямые повторы, инвертированные повторы, тандемные повторы и палиндромные последовательности, расположенные группами (кластерами).

Прямые повторы представляют собой повторяющиеся последовательности нуклеотидов, имеющие определенное число копий.

Прямой повтор может выглядеть следующим образом:

5'…​TACTGGCA …​ TACTGGCA.. …​3' (цифрами обозначены концы цепи ДНК, образованные 5'-фосфатной и 3'-гидроксильной группами, соответственно)

Инвертированный повтор представляет собой последовательность ДНК, имеющую зеркально расположенную копию:

5'…​ TGCCTGTA…​…​ATGACCGT …​3'

Тандемные повторы — тандемно повторяющиеся нуклеотидные последовательности: множественные копии последовательностей (единиц), следующие друг за другом. Например, ТАТАТАТА, это тандемный повтор динуклеотида ТА, CGGCGGCGG – тандемный повтор тринуклеотида СGG. Тандемные повторы в одном локусе у разных штаммов могут отличаться количеством повторяющихся единиц.

Палиндромные последовательности ДНК — последовательности, которые по каждой из цепей ДНК считываются одинаково как слева направо, так и справа налево.

Например, последовательность ДНК ACCTAGGT является палиндромной, поскольку ей на комплементарной цепи ДНК соответствует последовательность TGGATCCA, и обратный порядок нуклеотидов последовательности TGGATCCA соответствует последовательности ACCTAGGT.

Благодаря наличию участков, которые комплементарны сами себе, молекулы ДНК, содержащие палиндромы, способны формировать сложные структуры, напоминающие шпильки. Данные структуры, будучи нестабильными, играют важную роль в рекомбинационной изменчивости микроорганизмов.

Перечислим некоторые широко распространенные структурные элементы генома прокариот, содержащие повторяющиеся последовательности:

REP (сокр. англ. Repetitive Extragenic Palindrome). Наиболее распространенные короткие повторяющиеся последовательности. REP-элементы, впервые обнаруженные у Е. coli и S. enterica серовар Typhimurium, представляют собой палиндромы длиной 38 п. н. Они присутствуют в количестве 500–1000 копий на хромосому, имеют разную взаимную ориентацию, образуют тандемы или собраны в кластеры до 10 копий каждый. В настоящее время REP- и REP-подобные элементы выявлены у представителей большинства бактериальных семейств, что позволяет использовать их для внутривидового типирования, в том числе с использованием автоматизированных систем.

ERIC (сокр. англ. Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus). Первоначально 'nb инвертированные повторы длиной 126 п. н. были описаны у энтеробактерий. Затем оказалось, что эти элементы широко распространены у представителей домена Bacteria.

CRISPR (сокр. англ. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) — это обнаруженные в ДНК многих видов бактерий прямые повторы протяженностью 24–48 п. н., разделенные короткими вариабельными участками — так называемыми спейсерами (считают, что эти участки являются фрагментами фаговой ДНК). В пределах вида штаммы бактерий могут различаться наборами спейсеров.

Примером CRISPR может служить DR-локус хромосомы микобактерий туберкулезного комплекса, включающий несколько десятков коротких прямых повторов (англ. Direct Repeats) нуклеотидов, разделенных уникальными спейсерами (рис. 1). Полиморфизм этого локуса изучают с помощью метода сполиготипирования.

Аналогичные участки обнаружены в геномах Corynebacterium diphtheriae, Streptococcus группы А, Salmonella и других патогенных бактерий.

VNTR-локусы (сокр. англ. Variable Number of Tandem Repeats) содержат различное (вариабельное) число тандемных (сцепленных линейно «голова–хвост») повторов в определенных участках хромосомы (рис. 2).

Полиморфизм межгенной области рибосомного оперона. К особому типу повторяющихся последовательностей можно отнести гены, кодирующие синтез двух фракций рибосомной РНК — 16S и 23S. Эти гены, представленные в бактериальных хромосомах несколькими копиями, имеют вариабельную область между геном, кодирующим 16S, и геном 23S РНК (рис. 3).

Вариации этой межгенной области позволяют осуществлять межвидовую и внутривидовую дифференциацию штаммов с помощью метода риботипирования.

Сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции — это специфические последовательности ДНК, «узнаваемые» особыми ферментами — рестриктазами (эндонуклеазами рестрикции), которые способны разрезать двунитевые молекулы ДНК. В бактериальной клетке они распознают чужеродную ДНК и разрезают ее на фрагменты, выполняя, таким образом, защитную функцию. Каждая рестриктаза распознает только одну, специфическую последовательность нуклеотидов. Например, сайтом узнавания для рестриктазы EcoR1 является последовательность G|AATC (вертикальной линией обозначено место разреза), рестриктаза AluI распознает и разрезает последовательность AG|CT.

Рестриктазы, которых в настоящее время известно несколько сотен, используют для рестрикционного анализа молекул ДНК.

Мобильные генетические элементы, широко представленные в бактериальных геномах, представляют собой умеренные бактериофаги, транспозоны, а также IS-элементы (англ. Insertion Sequence) — «встраивающиеся последовательности», количество и расположение которых на хромосоме может варьировать у штаммов одного вида. Например, последовательность IS6110 Mycobacterium tuberculosis, IS200 — бактерий рода Salmonella, IS1548 — Streptococcus группы В являются генетическими маркерами штаммов.

Однонуклеотидные полиморфизмы (англ. Single Nucleotide Polymorphism, SNP) — точечные мутации в кодирующих (гены «домашнего хозяйства», гены вирулентности и др.) и некодирующих последовательностях геномной ДНК служат маркерами для оценки генетической однородности изолятов данного вида с помощью рестрикционного анализа и различных модификаций метода ДНК-секвенирования.

К числу методов молекулярно-генетического типирования относятся методы, основанные на полимеразной цепной реакции, методы рестрикционного анализа, гибридизации нуклеиновых кислот и ряд методов, основанных на секвенировании.

Как правило, в практических целях при расследовании вспышек используются молекулярно-генетические методы, позволяющие отнести тестируемые изоляты к тому или иному штамму, основываясь на наблюдаемом визуально наборе «полос» (фрагментов ДНК с разной электрофоретической подвижностью) на электрофореграмме (методы геномной дактилоскопии). Детекция проводится по количеству фрагментов ДНК и их молекулярному весу, который оценивается по молекулярному весу контрольных маркеров и выражается в парах нуклеотидов (bp). Такой индивидуальный набор «полос», являющийся специфическим для каждого изучаемого штамма, называется паттерном или фингерпринтом (фингерпринт - геномный «отпечаток пальца»).

К числу молекулярно-генетических методов, использующих фингерпринты для отнесения культур микроорганизмов к тому или иному штамму, относятся, например, метод RAPD– ПЦР (от англ. Random Amplification of Polymorphic DNA – избирательная амплификация полиморфной ДНК) и метод электрофореза ДНК в пульсирующем поле (кратко «пульс-электрофорез» или PFGE) (см. ниже).

Методы, основанные на полимеразной цепной реакции, являются достаточно широко распространенными при использовании в рутинной практике эпидемиологического надзора и при необходимости принятия экстренных решений (например, при расследовании вспышек) в связи с их относительной простотой, экспрессностью и низкой стоимостью.

К разновидностям метода генотипирования, основанного на ПЦР, относят методы ПЦР с «произвольными» праймерами (RAPD-ПЦР), ПЦР с идентификацией повторяющихся последовательностей ДНК (REP, ERIC-ПЦР), мультилокусный анализ VNTR (Variable Number Tandem Repeat) локусов (MLVA) .

Метод RAPD-ПЦР (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA) основан на отжиге при невысокой температуре одного праймера с произвольной короткой последовательностью на комплементарных участках обеих цепей ДНК. Число и локализация комплементарных праймеру участков хромосомной ДНК могут варьировать у штаммов одного вида. Как правило, родственные штаммы имеют одинаковые участки отжига праймера, что обеспечивает синтез ПЦР-продуктов различной молекулярной массы, которые выявляются в виде одинакового набора фрагментов на электрофореграмме (рис. 4). Наблюдаемый визуально набор полос на электрофореграмме, являющийся специфическим для каждого изучаемого штамма, называется паттерном (или фингерпринтом — геномный «отпечаток пальца»).

На рис. 5 представлены результаты RAPD-типирования изолятов Acinetobacter baumannii, выделенных при вспышке вентилятор-ассоциированной пневмонии в нейрохирургическом стационаре, вызванной единственным штаммом.

MLVA-типирование (мультилокусный анализ по VNTR-локусам (участкам с вариабельным числом тандемных повторов)) основано на идентификации рассеянных в хромосоме VNTR-локусов (участков, содержащих разное число тандемных повторов) при помощи ПЦР. Подобрав праймеры к консервативным концам VNTR-локуса можно, применив метод ПЦР с электрофоретической детекцией, определить его длину и, зная размер входящих в него тандемных повторов, определить их количество.

Поскольку различные изоляты содержат неодинаковое число повторов в VNTR-локусах, информация об их количестве позволяет отнести тестируемые культуры бактерий к тому или иному штамму.

Для повышения информативности и достоверности MLVA-анализа используют не один, а несколько (обычно 5–12) VNTR-локусов в зависимости от видовой принадлежности микроорганизма. Результат анализа записывают в виде цифрового профиля штамма, где каждая цифра обозначает число повторов в каждом VNTR-локусе. Например, результат может выглядеть так:

изолят A —2 — 16 —28 — 14 — 5 — 7

изолят В — 2 — 16 —28 — 14 — 5 — 7

изолят С — 2 — 10 — 32 —14 — 3 —1

Изоляты A и B в представленном примере могут быть отнесены на основании MLVA-типирования к одному штамму.

Методы, основанные на анализе рестрикционных профилей ДНК, включают ряд классических методов, которые, несмотря на то, что были разработаны сравнительно давно (несколько десятилетий назад), активно применяются на практике в настоящее время. Генетическими маркерами при использовании этой группы методов являются сайты узнавания рестриктазами, расположенные в плазмидной ДНК (рестрикционный анализ плазмид, RAP), в тотальной геномной ДНК (метод электрофореза в пульсирующем поле) или в ограниченном участке ДНК, амплифицированном методом ПЦР (метод оценки полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ПЦР продукта - ПДРФ-ПЦР).

Метод гель-электрофореза в пульсирующем поле (англ. Pulsed Field Gel Electrophoresis, синоним: метод пульс-электрофореза) признан «золотым стандартом» в типировании многих микроорганизмов. Суть данного метода заключается в том, что хромосомную ДНК изолятов микроорганизма расщепляют рестриктазами (часто используют эндонуклеазы рестрикции SmaI и XbaI) с тем, чтобы получить 10–20 фрагментов. Затем проводят электрофорез таким образом, чтобы направление электрического поля менялось с определенной частотой, т. е. ток подается в импульсном режиме в разных направлениях. В условиях «пульсирующего» электрического поля, в отличие от традиционного электрофореза с постоянным направлением электрического тока, крупные фрагменты ДНК получают возможность мигрировать через поры геля, что позволяет их разделить по массе. Результат электрофореза оценивают при окраске геля бромистым этидием и визуализации в ультрафиолетовом излучении. Профили рестрикции (паттерны) изолятов представляют собой наборы светящихся полос, соответствующих полученным в результате рестрикции фрагментам ДНК. Пульс-электрофорез обладает высочайшей разрешающей способностью, однако длительность, трудоемкость и необходимость использования дорогостоящего оборудования и реактивов ограничивают использование данного метода при расследовании вспышек. При проведении многоцентровых исследований с использованием данного метода требуется проведения внешнего контроля качества. Категория 2 (уровень доказательности - 3) [6].

Различные методы генотипирования часто сочетают с гибридизационной детекцией последовательностей ДНК. Для этого полученные фрагменты ДНК подвергают электрофорезу в агарозном геле, затем при помощи процедуры, которая по имени автора называется переносом по Саузерну (или Саузерн-блоттинг), переносят из геля на специальную нитроцеллюлозную мембрану и гибридизуют с зондом — комплементарной короткой последовательностью ДНК, меченной радиоактивной или нерадиоактивной меткой.

Продукты гибридизации визуализируют путем авторадиографии (в случае радиоактивного зонда) на светочувствительной пленке или оценивают окрашенные фрагменты на мембране. В качестве зондов часто используют меченые фрагменты IS-элементов, последовательности рибосомного оперона 16S–23S (метод риботипирования), другие последовательности (например, спейсеры DR-локуса Mycobacterium tuberculosis complex).

Анализ полиморфизма DR-локуса (участка, содержащего прямые повторы) хромосомы изолятов микобактерий туберкулеза называется методом сполиготипирования. Сполиготипирование (англ. spoligotyping, spacer oligonucleotide typing) основано на детекции 43 последовательностей, находящихся между прямыми повторами (direct repeats) линейно расположенных на хромосоме Mycobacterium tuberculosis complex. Данные последовательности называются спейсерами.

В ходе исследования продукты амплифицированного в ПЦР фрагмента DR-локуса исследуемых изолятов, помеченные специальным реагентом — биотином, гибридизуют с 43 спейсерными последовательностями, последовательно нанесенными на специальную мембрану, которую затем экспонируют на светочувствительной фотографической пленке. В случае если гибридизация произошла, биотин засвечивает фотографическую пленку. По наличию или отсутствию в определенных участках пленки темных пятен судят о присутствии или отсутствии у штаммов (изолятов) соответствующих спейсеров (рис. 6).

Как видно на рисунке, каждый штамм характеризуется определенной комбинацией спейсеров (черных пятен на фотографической пленке), т. е. имеет определенный сполиготип. Сполиготипы, имеющие незначительные отличия друг от друга по содержанию спейсеров, группируются в генетические семейства (известно, например, широко распространенное генетическое семейство Beijing, которое объединяет наиболее вирулентные и резистентные к терапии штаммы микобактерии туберкулеза). Сполиготипирование в комплексе с другими методами молекулярно-генетического типирования может быть использовано при расследовании случаев внутрибольничного инфицирования туберкулезом.

К числу гибридизационных технологий относят генотипирование с использованием генетических чипов (ДНК-микрочипов), которые позволяют с высочайшей степенью достоверности одномоментно определять десятки или даже сотни однонуклеотидных полиморфизмов и других генетических маркеров.

К основанию каждой из микроскопических ячеек чипа (пластинки размером около 1 см²) прикреплен олигонуклеотидный зонд, комплементарный какой-либо последовательности ДНК или фрагменту какого-либо гена. Гибридизация исследуемой ДНК с использованием генетического чипа позволяет одновременно протестировать наличие или отсутствие нескольких сотен кодирующих последовательностей (генов) или некодирующих последовательностей, являющихся генетическими маркерами. Таким образом, одномоментно можно получить информацию о большом количестве мобильных генетических элементов или генов вирулентности, что является весьма важным при генетическом типировании с эпидемиологическими целями.

Наиболее точными и, по-видимому, наиболее перспективными становятся методы молекулярного типирования, основанные на секвенировании ДНК — определении первичной последовательности нуклеотидов (сиквенса) в одном вариабельном (однолокусное секвенирование) или нескольких (мультилокусное секвенирование, MLST) участках. При этом изоляты с одним и тем же сиквенсом (например, с одинаковым спектром мутаций) относят к одному штамму.

Современные варианты секвенирования основаны на ПЦР, в которой используются специальные нуклеотиды (2',3'-дидезоксинуклеотиды — ddNTP), способные при встраивании в цепочку ДНК в случайном месте блокировать ее дальнейший синтез. Раствор ДНК, содержащий последовательность, которую предполагается прочесть, и подходящий к ней праймер, распределяют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP, и один из четырех 2',3'- дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность.

Для автоматического секвенирования используют ddNTP, меченые флюоресцентными красителями. Чтение последовательности ДНК происходит в процессе электрофореза, например в тонких капиллярных трубках, заполненных гелем. При этом луч лазера в определенном месте геля возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель. Результаты секвенирования выглядят как график (хроматограмма), где каждому нуклеотиду соответствует определенный пик флюоресценции.

Полученная первичная информация подвергается компьютерной обработке с помощью специального программного обеспечения.

Для большинства патогенов сейчас разработаны унифицированные методы однолокусного или многолокусного (MLST) секвенирования — типирования, результаты которых могут быть внедрены в международные компьютерные базы данных, доступные online.

В последнее время в практику активно внедряются технологии секвенирования нового поколения (next generation sequencing, NGS), которые позволили существенно повысить производительность секвенирования и удешевить эту процедуру. С помощью секвенирования нового поколения расшифрованы геномы множества микроорганизмов — возбудителей инфекционных заболеваний.

Выбор методов генетического типирования для молекулярно-генетического мониторинга определяется задачами, поставленными в рамках эпидемиологического надзора за ИСМП. Для оперативного анализа локальных эпидемических вспышек используются быстрые и относительно дешевые методы, как правило, основанные на ПЦР (например, RAPD-ПЦР, ПЦР-RFLP и т. п.).

Методы, имеющие высокую разрешающую способность и высокую межлабораторную воспроизводимость результатов, могут быть применены для оценки циркуляции международных эпидемических клонов, слежения за ходом эволюции тех или иных генетических линий возбудителей ИСМП, а также как референтные методы в сомнительных случаях. К ним можно отнести методы, основанные на секвенировании (мультилокусное или однолокусное секвенирование-типирование), электрофорез в пульсирующем электрическом поле.

Неотъемлемой частью молекулярно-эпидемиологического мониторинга является слежение как за фенотипами резистентности возбудителей ИСМП к АМП, так и за механизмами резистентности, имеющими клиническое и эпидемиологическое значение. Европейская система надзора за резистентностью к АМП (EARS-Net) включает мониторинг циркуляции выделенных из крови и ликвора штаммов E.coli, K.pneumoniae, P.aeruginosa, Acinetobacter spp., S.pneumoniae, S. aureus, E.faecalis, E.faecium, устойчивых к клинически важным антибиотикам: цефалоспоринам, карбапенемам, гликопептидам, фторхинолонам и аминогликозидам (таблица 3). http://ecdc.europa.eu/ en/publications/Publications/antimicrobial-resistance-surveillance-europe-2013.pdf)

Особое значение при мониторинге уделяют штаммам:

— метициллинрезистентных S.aureus (MRSA);

— E.coli и K.pneumoniae, продуцирующим БЛРС и устойчивым к карбапенемам;

— P.aeruginosa и Acinetobacter spp., устойчивым к карбапенемам;

— E.faecalis и faecium, устойчивым к гликопептидам (ванкомицин-резистентные Enterococcus, VRE).

Изучение механизмов резистентности микроорганизмов к АМП проводится с использованием как фенотипических (подтверждающие тесты в формате диско-дифузионного метода, латекс-агглютинация и др.), так и молекулярно-генетических методов (детекция генов, ответственных за конкретные механизмы резистентности).

Врач-бактериолог использует фенотипические методы, которые позволяют оценить чувствительность бактерий к АМП и предположить конкретный механизм резистентности. В большинстве случаев достаточно определять чувствительность к набору АМП, рекомендованному нормативными документами, действующими в РФ. При повседневном тестировании штаммов возбудителей ИСМП и других заболеваний некоторые препараты (не применяемые для лечения) внесены в «обязательный» перечень для того, чтобы выявить определенный механизм резистентности.

Например, для детекции у штаммов Staphylococcus spp. устойчивости к бета-лактамным препаратам, обусловленной наличием ПСБ2а (так называемые метициллинрезистентные Staphylococcus), следует определять чувствительность к цефокситину, как наиболее чувствительному препарату, позволяющему выявить данный механизм (ранее для этих целей использовали оксациллин).

Для выявления штаммов Enterobacteriacae, продуцирующих БЛРС, рекомендовано одновременное тестирование двух наиболее чувствительных препаратов из группы цефалоспоринов 3-4 поколения: цефтазидима и цефотаксима.

Чтобы достоверно выявить штаммы Enterobacteriacae, продуцирующие карбапенемазы, из группы карбапенемов следует тестировать меропенем как препарат, обладающий достаточной чувствительностью и специфичностью для выявления этого механизма резистентности.

Устойчивость к фторхинолонам (ципрофлоксацину, норфлоксацину, левофлоксацину и др.), которая в настоящее время широко распространена у штаммов Enterobacteriacae и обусловлена, как правило, мутациями в определенном регионе хромосомы, достоверно выявляется при тестировании наиболее «раннего» хинолона - налидиксовой кислоты. Выявленная устойчивость к этому препарату (несмотря на результат лабораторного исследования «чувствительный» к фторхинолонам) позволяет прогнозировать неудовлетворительный исход лечения фторхинолонами ОКИ и ИМВП.

При решении эпидемиологических задач по ограничению распространения резистентных штаммов/генов резистентности в популяции возбудителей ИСМП большое значение имеют результаты так называемых «подтверждающих» тестов и молекулярно-генетическая детекция механизмов резистентности.

В настоящее время молекулярные методы являются эффективным инструментом экспресс диагностики механизмов резистентности бактерий к АМП и широко используются в научных исследованиях. Применение этих методов для микробиологического мониторинга в системе эпидемиологического надзора за ИСМП позволяет существенно повысить эффективность и скорость выявления механизмов резистентности, имеющих существенное клиническое и эпидемиологическое значение. Это условие в полной мере относится к детекции MRSA, VRE, БЛРС и карбапенемаз. Молекулярные методы, направленные на выявление механизмов резистентности возбудителей ИСМП, как правило, основаны на ПЦР с электрофоретической детекцией, ПЦР в режиме реального времени, а также ПЦР с гибридизацией на ДНК-чипах. Преимуществом этих методов является высокая скорость получения результатов, высокая стандартизованность и невысокая трудоемкость. В РФ зарегистрированы отечественные наборы реагентов для выявления некоторых механизмов резистентности возбудителей ИСМП методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени (Таблица 4).

Для детекции метициллин-резистентных Staphylococcus (как S.aureus, так и КНС) разработан набор реагентов для ПЦР-РВ «Амплисенс MRSA-скрин-титр-FL», который позволяет выявить видоспецифический ген S.aureus и ген mecA, обуславливающий устойчивость к бета-лактамам. Набор «АмплиСенс^®MBL- FL» позволяет выявлять гены металло-бета-лактамаз групп VIM, IMP и NDM, набор «АмплиСенс^®MDR KPC/OXA-48-FL» - гены карбапенемаз групп KPC и OXA-48, характерные для энтеробактерий. Кроме того, в настоящее время разрабатывается набор, направленный на выявление генов OXA-карбапенемаз, характерных для Acinetobacter spp. (группы OXA-23-подобных, OXA-58-подобных и OXA-40/24-подобных). Преимуществом данных наборов является возможность анализировать различные образцы – чистые культуры, гемокультуры, посев ликвора на среду обогащения, а также исходный биологический материал (например, мочу при острых инфекциях мочевыводящих путей или мазки со слизистых оболочек ротоглотки и прямой кишки), что делает их незаменимым инструментом при проведении скрининга или эпидемиологических исследований. Наборы обладают высокой чувствительностью и специфичностью.

Еще одним аспектом проблемы антибиотикорезистентности является глобальное распространение определенных полирезистентных генетических клонов микроорганизмов. В силу сочетания различных факторов (множественная устойчивость к АМП и дезинфектантам, вирулентность, выживаемость в окружающей среде и др.) те или иные генетические линии (клоны) микроорганизмов становятся более «успешными», чем другие представители этого вида и начинают доминировать в популяции возбудителей (как внебольничных, так и внутрибольничных). Многие возбудители ИСМП, выделяемые в настоящее время на территории РФ, принадлежат к международным эпидемическим клонам.

Широкое развитие авиасообщений приводит к тому, что сегодня в российский стационар может поступить пациент, который несколько дней назад находился в стационаре в другой части света. Госпитализация нередко сопряжена с риском инфицирования полирезистентными клонами микроорганизмов, которые перемещаются вместе с пациентами из стационаров одной страны в стационары другой страны, где они ранее не циркулировали. В этих условиях в каждом стационаре первостепенное значение приобретает изучение не только устойчивости возбудителей ИСМП к АМП, но и их принадлежности к определенным молекулярным типам (генетическим линиям, клонам). Современные методы генотипирования (особенно основанные на секвенировании) позволяют достаточно быстро получить результаты, которые можно сравнить с международными базами данных.

Многоцентровые исследования, проводимые в последние годы в стационарах России, показали, что доминирующими молекулярными сиквенс-типами S.aureus (при генотипировании методом MLST) являлись ST239 и ST8 - эволюционно успешные клоны, широко распространенные во всем мире. Среди этих генетических линий встречаются как метициллин-чувствительные, так и метициллин-устойчивые штаммы; как внутрибольничные, так и внебольничные штаммы [26].

В настоящее время во многих странах среди штаммов E.coli, вызывающих ИСМП, значительную долю занимает клон E.coli ST131 О25:Н4, характеризующийся устойчивостью к ЦРС (за счет продукции БЛРС СТХ-М15) и фторхинолонам (за счет двух хромосомных мутаций в генах qyrA и parC) [27].

Среди штаммов K.pneumoniae, устойчивых к карбапенемам, в странах Европы, Израиле, США и Китае доминирует клон ST258, продуцирующий карбапенемазу КРС-2. Другие генетические линии (ST147, ST383, ST133, ST274 и ST323) занимают значительно меньшее место [28, 29]. Сведений о циркуляции таких штаммов в РФ пока нет.

С 1997 г. в стационарах России, Беларуси и Казахстана установлена циркуляция международного клона P.aeruginosa ST235 [30]. Штаммы, относящиеся к этому сиквенс-типу, характеризуются множественной резистентностью, в том числе устойчивы к карбапенемам и являются донором генов МБЛ (чаще всего VIM-2, а также IMP), вызывают ИСМП у пациентов хирургических и ожоговых отделений [31, 32].

Таким образом, молекулярно-генетическая характеристика штаммов с использованием комплексного подхода, включающего фенотипические и молекулярные методы, позволяет проводить молекулярно-эпидемиологический мониторинг в системе эпидемиологического надзора за возбудителями ИСМП.

Учитывая технические и методические возможности, имеющиеся в лабораториях ЛПМО и научных организаций, представляется целесообразным дифференциация видов исследований на различных уровнях (этапах) проведения молекулярно-генетического мониторинга.

На первом этапе в рамках рутинного микробиологического мониторинга (мониторинга антибиотикорезистентности), проводимого в ЛПМО, отбираются штаммы, имеющие идентичный или сходный профиль внутривидового типирования, проведенного с использованием методов, доступных лаборатории ЛПМО (антибиотикотипирование, фаготипирование и т.п.). Затем данные штаммы подвергаются генетическому типированию доступными методами, основанными на ПЦР (MLVA, RAPD).

Штаммы, отнесенные к одной и той же клональной линии по результатам генетического типирования с учетом данных эпидемиологического наблюдения в стационаре, могут быть интерпретированы как госпитальные штаммы. Генетическое типирование на данном этапе могут выполнять как лаборатории стационаров, использующие в своей практике метод ПЦР, так и лаборатории, выполняющие функции региональных центров по мониторингу за возбудителями внутрибольничных инфекций (референс-лаборатории). Следующий этап предполагает типирование репрезентативных выборок из наиболее распространенных в стационарах региона госпитальных штаммов методами основанными на секвенировании-типировании (spa-сиквенстипирование, MLVA), методом PFGE или иными методами с высокой дискриминирующей способностью. В результате, региональные и национальные референс-лаборатории получают возможность осуществлять слежение за динамикой распространения в регионе штаммов, отнесенных к международным клональным линям (эпидемическим или пандемическим клонам).

Таким образом, локальный молекулярно-генетический мониторинг включает идентификацию госпитальных штаммов методами, основанными на ПЦР (MLVA, RAPD). Молекулярно-генетический мониторинг, осуществляемый на региональном и национальном (глобальном) уровнях, должен быть направлен на идентификацию эпидемических клонов, анализ их происхождения и связи с другими географическими регионами с использованием международных баз данных.

Передача микроорганизмов в референс – лабораторию должна осуществляться при наличии показаний к молекулярно-генетическому типированию, представленных в п.8.1.

При необходимости длительного хранения культур от момента выделения до отправки в референс - лабораторию выделенные микроорганизмы следует хранить в лаборатории ЛПМО в пробирках со средой для хранения (например триптазо-соевом бульоне с добавлением 15% глицерина) при температуре -18 - 20 С (в морозильной камере холодильника). Допустимо также хранение культур в столбиках полужидкого агара при температуре +4 - +7 С.

Лаборатории ЛПМО предоставляют культуры в пробирках в столбиках полужидкого агара или используют для передачи культур транспортные системы с транспортной средой (например, со средой Стюарта).

Каждая культура должна сопровождаться направлением, содержащим информацию о больном, сведения о характере гнойно-септической инфекции, обусловленной выделенным микроорганизмом, о предполагаемых факторах риска колонизации данным микроорганизмом.

Информация о пациентах является конфиденциальной и поэтому, в графе ФИО приводятся только инициалы пациента, которые будут зашифрованы в процессе дальнейшей обработки данных.

Далее указываются наименование учреждения и лаборатории, ФИО лица, направившего культуру, номер культуры по журналу и дата ее отправки в референс- лабораторию. Образец карты сбора информации на культуру микроорганизма, передаваемую в референсную лабораторию приведен в приложении 1.

Референсная лаборатория предоставляет заинтересованным сторонам заключение по результатам проведенных исследований, в котором должна быть представлена следующая информация:

— количество изученных полученных культур микроорганизмов;

— краткое описание используемой методики генотипирования с указанием используемого оборудования и программного обеспечения, при использовании метода прямого секвенирования — размеров и расположения анализируемых участков генома;

— при использовании методик, результаты которых имеют форму паттернов (фингерпринтов) (MLVA, PFGE) — графическое представление полученных результатов в виде электрофореграммы и дендрограммы (филогенетического дерева), полученной в результате анализа паттернов типирования.

Идентификация международных эпидемических клонов возбудителей осуществляется на основании сопоставления данных молекулярно-генетического типирования, проведенного в референс-лаборатории, с данными, представленными в международных электронных базах данных генотипов микроорганизмов, или на основании сравнения с данными, полученными в других регионах (другими референсными лабораториями).

В настоящее время для решения задач «глобальной эпидемиологии» и слежения за распространением международных эпидемических клонов возбудителей активно применяются базы данных, основанные на использовании метода мультилокусного секвенирования — типирования (MLST): www.mlst.net и www.pubmlst.org, а также базы данных Парижского института Пастера www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst .

Эти базы данных позволяют сопоставлять полученные исследователем результаты MLST-типирования с уже имеющимися в них данными. Имеется возможность выбора данных по географии штаммов, подвергшихся типированию, по типу клинических проявлений (например, можно выбрать только инвазивные изоляты), по типу эпидемиологических проявлений, связанных с ними (например, можно выбрать спорадические или эпидемические штаммы). Кроме того, имеется возможность построить при помощи алгоритма eBURST дендрограмму, отражающую филогенетические взаимоотношения штаммов, выбранных по заданному критерию. Например, на рис. 7 представлено филогенетическое дерево штаммов S.aureus, выделенных в России.

Аналогичными возможностями обладают базы данных, основанные на использовании других методов генотипирования. Например, в отношении S.aureus хорошо зарекомендовал себя метод секвенирования одного вариабельного гена поверхностного протеина А (т. н. метод spa-секвенстипирования). Данный ген имеет множество вариантов (аллелей) в зависимости от числа и состава прямых повторов в нем. Электронная база данных spa-типов доступна по адресу http://spa.ridom.de.

При сопоставлении результатов типирования методом MLVA используют базу данных MLVAbank (http://mlva.u-psud.fr/mlvav4/genotyping/).

В настоящий момент считается установленным, что возбудители ИСМП в ходе циркуляции в стационарах подвержены генетическим изменениям, выражающимся в формировании подтипов внутри доминирующего клона. Так, например, штаммы MRSA, сохраняющие свой паттерн PFGE-типирования при многочисленных пересевах in vitro, при циркуляции в условиях стационара генерируют множество подтипов, связанных с доминирующим PFGE-типом, причем наиболее активно этот процесс идет в течение эпидемилогически «турбулентных» периодов вспышек [33, 34]. Предполагается, что данный феномен связан с приобретением крупных мобильных генетических элементов, таких как транспозоны.

В связи с данным обстоятельством, установление эпидемиологических связей и отнесение тестируемых изолятов к одному штамму (клональной линии) на основании молекулярно-генетического типирования должно включать в себя количественную оценку степени генетического родства между изолятами с помощью филогенетического анализа. Филогенетический анализ основан на оценке эволюционных дистанций - т.е. количества генетических изменений у сравниваемых изолятов (например, относительного количества нуклеотидных замен в молекуле ДНК или РНК). Чем меньше эволюционные дистанции между сравниваемыми культурами микроорганизмов, тем более они родственны друг другу и тем более вероятным является отнесение их к одному госпитальному или эпидемическому штамму.

Степень филогенетического родства между штаммами микроорганизмов может быть отображена графически в виде дендрограммы (филогенетического дерева). Дендрограммы, используемые в молекулярной эпидемиологии, строят на основании эволюционных дистанций, полученных в результате генотипирования. Существует ряд компьютерных программ, позволяющих построить филогенетические деревья на основании данных генетического типирования.

Например, соответствующая функция построения дендрограмм по качественным признакам (таким, как наличие или отсутствие полос на электрофореграмме при использовании метода PFGE или RAPD) представлена на интернет-ресурсе http://insilico.ehu.es/dice_upgma.

Для построения дендрограммы с использованием данного интернет-ресурса необходимо закодировать результаты генетического типирования. При этом каждой полосе (бэнду) в паттерне генотипирования (полученного при проведении PFGE или RAPD) соответствует значение «1» – если полоса (ПЦР-продукт) соответствующей молекулярной массы присутствует в паттерне и значение «0» - если полоса (ПЦР-продукт) соответствующей молекулярной массы отсутствует в паттерне. Обозначение паттернов типирования, в этом случае может выглядеть следующим образом:

Штамм1: 0;1;1;0;0;1;1;0;1;0;1;1;1;0;0;1;0;0;0;1;1;1;0;1;
Штамм 2: 0;1;1;0;0;1;1;0;1;0;1;1;1;0;0;1;0;0;0;1;1;0;0;1;
Штамм 3: 0;1;1;0;0;1;1;0;1;0;1;1;1;0;0;1;0;0;0;1;1;0;1;1;
Штамм 4: 0;1;1;0;0;1;1;0;1;0;1;1;1;0;0;1;0;0;0;1;1;0;0;1;
Штамм 5: 0;1;1;0;0;1;1;0;1;0;1;1;1;0;0;1;0;0;1;1;1;0;0;1;
Штамм 6: 0;1;1;0;0;1;1;0;1;0;1;1;1;0;0;1;0;0;0;1;1;0;0;1;
Штамм 7: 0;1;1;0;0;1;1;0;1;0;1;1;1;0;0;1;0;0;0;1;1;0;0;1;

а дендрограмма, построенная по результатам генотипирования, приведенного в примере выглядит следующим образом:

Наиболее достоверным способом установления филогенетического родства между штаммами является использование результатов секвенирования одного или нескольких вариабельных генов (однолокусное и многолокусное секвенирование - типирование). Кластеризация результатов секвенирования – типирования и построение дендрограмм может быть проведена с использованием различных компьютерных программ, в частности пакета программ MEGA [35]. Использование данной программы является бесплатным, дистрибутив программы доступен для скачивания по адресу URL :http://www.megasoftware.net/mega.php. (дата обращения 12.11.2014).

После построения дендрограммы необходимо оценить ее топологию (расположение ветвей и наличие кластеров штаммов). Изоляты, находящиеся в одном кластере, как правило, относят к одному эпидемическому штамму (клону) или клональному комплексу, поскольку филогенетическое родство входящих в кластер изолятов фактически означает, что между ними существовали эпидемические связи.

В зависимости от топологии филогенетического дерева различают звездообразную (star-like) или кактусообразную (cactus-like) филогению.

Для звездообразной филогении характерно наличие на дендрограмме коротких внутренних ветвей при относительно длинных внешних ветвях, т. е. различные филогенетические линии отпочковываются практически из одной точки.

Кактусообразная филогения характеризуется наличием длинных внутренних ветвей, которые отделяются через значительные промежутки времени.

Звездообразная филогения характерна для периода эпидемического распространения, при этом предэпидемический период до момента появления высококонтагиозного эпидемического клона будет характеризоваться кактусообразной филогенией.

Секвенирование целых геномов микроорганизмов позволяет получить наиболее полную информацию о генетических особенностях изучаемых штаммов, включая наличие отдельных генов и мобильных генетических элементов, определяющих патогенный и эпидемический потенциал изучаемого штамма. Полногеномное секвенирование может быть использовано при изучении молекулярной эпидемиологии возбудителей ИСМП, для верификации филогенетических связей между эпидемическими штаммами, циркулирующими в различных географических регионах. При этом проводят сравнение геномов эпидемических штаммов, идентифицированных в различных географических регионах и выявляют кластеры штаммов, на основании которых судят о степени генетического родства штаммов, циркулирующих на различных территориях. Аннотирование (расшифровка) геномов микроорганизмов может быть проведена в автоматическом режиме с использованием сервиса, представленного на web-ресурсе RAST (http://rast.nmpdr.org). Поиск генов антибиотикорезистентости в секвенированных бактериальных геномах может быть проведен с использованием программы ResFinder 2.0 (http://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/), генов вирулентности – с использованием программы PathogenFinder (http://cge.cbs.dtu.dk/services/PathogenFinder/).